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Pierce™ 交聯(lián)磁性 IP/Co-IP 試劑盒

Thermo Scientific Pierce 交聯(lián)磁性 IP/Co-IP 試劑盒使用交聯(lián)化學方法將 IP 抗體共價固定在優(yōu)質(zhì)蛋白 A/G 磁珠上，以實現(xiàn)有效的免疫沉淀和免疫共沉淀。

因為該磁性 IP 程序涉及用于免疫沉淀的特異性抗體的共價結(jié)合，所以可在不使用抗體片段的情況下洗脫和分析靶蛋白或 co-IP 蛋白復(fù)合物，原因是該抗體仍黏附在微珠上。該試劑盒包含優(yōu)化的方案以及使用與蛋白 A/G 結(jié)合的抗體和手動或自動磁性分離工具用于獲得高得率 IP 或 co-IP 所必需的所有緩沖液和試劑。

交聯(lián)磁性 IP/Co-IP 試劑盒的特點：

•無抗體 IP—抗體與磁珠不可逆地連接，使得完整抗體或含有純化抗原的重鏈和輕鏈的共洗脫可忽略不計
•便利—IP/co-IP 試劑盒包含磁珠以及所有用于理想免疫沉淀所必需的緩沖液
•快速—可在 3 小時內(nèi)完成交聯(lián)和免疫沉淀
•高效—與其他磁珠相比，使用一半推薦體積的磁粒子進行免疫沉淀
•兼容—與蛋白 A/G 重組蛋白偶聯(lián)的磁珠可確保與大多數(shù)一抗（無論來自小鼠還是兔）兼容
•可擴展—僅需使用少量抗體即可進行單次 IP 實驗或制備更大數(shù)量的抗體交聯(lián)磁珠進行多次實驗

Pierce 交聯(lián)磁性 IP/Co-IP 試劑盒的方案為使 IP 抗體與蛋白 A/G 磁性微珠結(jié)合，然后使用辛二酸二琥珀酰亞胺酯 (DSS) 將抗體共價交聯(lián)至微珠。然后將抗體交聯(lián)微珠與含有目標蛋白抗原的細胞裂解物或組織提取物一起孵育，使得抗原:抗體復(fù)合物可以形成。洗滌微珠以去除未結(jié)合的材料，并使用低 pH 值洗脫緩沖液從抗體-交聯(lián)微珠分離結(jié)合的抗原。包括中和緩沖液，以防止分離抗原沉淀，并確保下游應(yīng)用中的蛋白活性。包含用于制備 SDS-PAGE 分析樣品的泳道標志物樣品緩沖液。該方案針對 2 至 10 µg IP 抗體進行了優(yōu)化。為獲得較佳 co-IP 得率，使用 5 至 10 µg 抗體。使用磁力架手動從溶液中取出磁珠或者使用 Thermo Scientific KingFisher Flex 儀器等儀器通過自動化操作從溶液中取出磁珠。

傳統(tǒng) IP（無共價抗體連接）的抗原得率通常高于使用交聯(lián)的 IP 方案。這是因為交聯(lián)過程不可避免地會引起一些功能性抗體結(jié)合位點的損失。為了克服交聯(lián)方法的這一限制，在交聯(lián) IP 方法中需要使用的 IP 抗體量可能多于等效傳統(tǒng) IP 程序。當然，交聯(lián)免疫沉淀程序的優(yōu)勢在于 Western 印跡無干擾抗體條帶。

方案總結(jié)
1：用 1X 偶聯(lián)緩沖液預(yù)洗微珠。
2：使抗體與蛋白 A/G 磁珠結(jié)合 15 分鐘。
3：用 1X 偶聯(lián)緩沖液洗滌微珠三次。
4：使用 DSS 將抗體交聯(lián)至微珠，持續(xù) 30 分鐘。
5：用洗脫緩沖液洗滌微珠三次，然后用 IP 裂解/洗滌緩沖液洗滌兩次。
6：將細胞裂解物與制備的微珠在室溫下孵育 1-2 小時或在 4°C 下過夜孵育。
7：用 IP 裂解/洗滌緩沖液洗滌微珠兩次，然后用純化水洗滌一次。
8：洗脫結(jié)合抗原。

Pierce™ 交聯(lián)磁性 IP/Co-IP 試劑盒